Dr. Stephan Lücke: PhD thesis

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mRNA synthesis in trypanosomes involves processing of a polycistronic primary transcript through trans splicing and polyadenylation, thereby generating the mature 5´- and 3´-ends of the mRNA. Through trans splicing the exons of two independently transcribed RNAs are joined with each other: the spliced leader (SL) RNA, which donates its 5´-terminal mini-exon sequence, and the polycistronic pre-mRNA, which contains the protein-coding exon sequences.

In part one of this work in vivo assays were established to study in detail trans splicing, cap4 modification, and RNP assembly of the SL RNA in the trypanosomatid species Leptomonas seymouri. First, extensive sequences within the mini-exon were found to be required for SL RNA function in vivo, although a conserved length of 39 nucleotides is not essential. In contrast, the intron sequence appears to be surprisingly tolerant to mutation; only the stem-loop II structure is indispensable. The asymmetry of the sequence requirements in the stem I region suggests that this domain may exist in different functional conformations. Second, distinct mini-exon sequences outside the modification site itself are important for efficient cap4 formation. Third, all SL RNA mutations tested allowed core RNP assembly, suggesting flexible requirements for core protein binding. In sum, the results of the mutational analysis provide evidence for a discrete domain structure of the SL RNA and help to explain the strong phylogenetic conservation of the mini-exon sequence and the overall SL RNA secondary structure; they also suggest that there may be certain differences between trans splicing in trypanosomes and nematodes. This approach provides a basis for studying RNA-RNA interactions in the trans spliceosome.

In comparison to conventional cis splicing the trans splicing process is not well understood. In analogy to cis splicing we assume, that trans splicing requires the assembly of the two precursor RNAs into a large structure, the trans spliceosome. Only a few RNA and protein components have been identified in trypanosomes that are relevant for trans splicing. In particular the U2, U4 and U6 snRNAs are essential cofactors of the trans splicing reaction. An important question has been whether a trans-spliceosomal homologue of the U5 RNA exists in trypanosomes. In part two of this work I describe the cloning and sequencing of a genomic region from Trypanosoma brucei that contains a PRP8/p220-homologous gene (p277) coding for a 277 kDa protein. The p277 protein was found to be highly homologous to the yeast protein PRP8, which is a specific component of the U5 snRNP and a highly conserved, essential splicing factor involved in 3´-splice site recognition and selection. Through p277 a U5-analogous RNA could be identified in trypanosomes that is part of a stable RNP complex and associated not only with the p277 protein, but also with the common proteins present in the other trans-spliceosomal snRNPs. Together these results demonstrate that a U5-analogous RNP exists in trypanosomes and suggest that basic functions of the U5 snRNP are conserved between cis and trans splicing.

Die mRNA-Synthese der Trypanosomen erfordert die Prozessierung von polycistronischen Primärtranskripten durch trans-Splicing und Polyadenylierung. Durch trans-Splicing werden die Exons zweier unterschiedlicher RNAs miteinander verknüpft: das Miniexon, welches am 5´-Ende der Spliced Leader (SL) RNA gefunden wird, und die proteinkodierenden Exons eines polycistronischen Transkripts.

Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Etablierung von in vivo-Systemen beschrieben, auf deren Basis das trans-Splicing, die cap4-Modifizierung und die Core-RNP-Bildung der SL RNA aus Leptomonas seymouri im Detail untersucht werden konnte. Die Studien zeigten, daß (1) ausgedehnte Bereiche des Miniexons für die trans-Splicing-Funktion der SL RNA in vivo benötigt werden, obwohl eine konservierte Länge von 39 Nukleotiden hierfür nicht essentiell ist. Im Gegensatz dazu wurden Mutationen des Intronbereichs überwiegend toleriert, lediglich die Stem-Loop II-Struktur war unverzichtbar. Die asymmetrischen Sequenzvoraussetzungen im Bereich von Stem I deuten auf zwei alternative Konformationen unterschiedlicher Funktion hin. (2) Für die cap4-Modifizierung sind auch Sequenzen außerhalb der Modifizierungsstelle wichtig. (3) Keine der getesteten Mutationen interferierte mit der Bildung des Core-SL RNPs; die Voraussetzungen für die Proteinbindung sind somit flexibel. Zusammengefaßt ergibt sich eine diskrete Domänenstruktur der SL RNA, die im Einklang mit der unterschiedlichen phylogenetischen Konservierung der Miniexon- und Intronsequenzen der SL RNA ist.

Im Vergleich zum cis-Splicing ist unser Wissen über die trans-Splicing-Reaktion sehr begrenzt. Analog dem cis-Splicing nimmt man an, daß sich an der polycistronischen prä-mRNA ein großer katalytischer RNA-Protein-Komplex formt, das trans-Spliceosom. Nur wenige Kompo-nenten des trans-Spliceosoms sind bislang bekannt; hierzu gehören die essentiellen U2, U4 und U6 snRNA-Kofaktoren. Lange Zeit war nicht klar, ob eine U5-ähnliche snRNA am trans-Splicing der Trypanosomen beteiligt ist. Der zweite Teil der Arbeit setzt bei dieser Fragestellung an. Durch die Klonierung und Sequenzierung einer genomischen Region von Trypanosoma brucei wurde ein PRP8/p220-homologes Gen (p277) identifiziert, welches für ein 277 kDa großes Protein kodiert. Das p277-Protein zeigt eine ausgedehnte Homologie zum hoch-konservierten Splicing-Faktor PRP8/p220, der Bestandteil des U5 snRNPs ist und wichtige Funktionen bei der Erkennung und Selektion der 3´-Splice Site ausübt. Mittels des p277-Proteins gelang die Identifizierung einer U5-analogen RNA der Trypanosomen, die in einem stabilen RNP-Komplex vorkommt. In diesem Partikel ist die U5 RNA nicht nur mit dem p277-Protein, sondern zusätzlich mit den Common Proteins assoziiert, die alle trans-spliceosomalen snRNPs gemeinsam haben. Die Ergebnisse zeigen, daß in den Trypanosomen ein U5-analoger snRNP existiert und deuten an, daß wichtige Funktionen des U5 snRNPs bei cis- und trans-Splicing konserviert sind.